十一長假結束，小編正式回歸。zui近新聞也是目不暇接，前有國人屠呦呦獲諾貝爾生理學和醫(yī)學獎，后有AB教主的世紀婚禮。為了讓還在倒時差的各位親們能更好 的跟上時代的新步伐，小編特意整理了哥家9月 24日下午19:15 ~21:00由資深技術專家?guī)淼摹皢慰寺】贵w藥物純化工藝探索與開發(fā)"精彩Q&A回顧。錯過的親們，讓我們一起再次感受知識的力量吧！
1干貨回答 讓您分分鐘了解抗體純化工藝
什么是反壓、壓力降？
答疑解惑
“了解基本名詞術語"
反壓是層析過程中，泵產(chǎn)生流速，流速作用層析柱產(chǎn)生的壓力。如下圖所示：
| 層析柱的反壓以及壓力降 |  |
| 圖為?KTA Avant 的壓力顯示 |
0.5MPa 為層析柱的反壓，壓力降為0.3MPa
層析柱產(chǎn)生反壓：主要是層析介質(zhì)，層析柱的設計，層析柱篩板等。真正影響層析介質(zhì)的為壓力降，壓力降高于層析介質(zhì)的耐壓，層析介質(zhì)會損壞。
層析填料入廠檢驗做哪些比較合適？
答疑解惑
“填料檢驗多重標準"
原料入廠GMP要求做檢測，合格才能進廠使用。一般有幾種方法：
審計供應商 | 做供應商審計是否復合ISO等要求，確認此供應商符合我項目要求，所以可以免檢。 |
自己檢測 | 此需要在工藝開發(fā)中做層析介質(zhì)重要參數(shù)對產(chǎn)品質(zhì)量的確定。（例如：層析介質(zhì)的顆粒在XX-XXum時，產(chǎn)品的質(zhì)量才能到達要求，并且供應商的產(chǎn)品不同批次 的顆粒有較大差別，所以確定顆粒為比檢項目）。對于這個問題，國外藥廠一般在工藝開發(fā)時，至少做3批不同批號的層析介質(zhì)實驗以確定供應商出廠指標范圍內(nèi)可 以滿足要求。 |
Protein A和Protein G兩種介質(zhì)在純化抗體有何區(qū)別，結合位點各有幾個？
答疑解惑
“Protin A和G的區(qū)別結合位點"?
| Protein G 的結合位點 | Protein G與Ig G的Fc結合，同時也可以結合IgG CH1區(qū)域。此配基為 17KD， PI 4.1. 在全抗體或Fc融合蛋白的純化中由于Protein A 層析介質(zhì)的載量高于Protein G，所以一般使用Protein A層析介質(zhì)。 |
| Protein A 的結合位點 | 與IgG結合的亞類主要是IgG1、IgG2和IgG4。 |
| Protein A與抗體IgG 結合區(qū)域 | Protein A與抗體IgG 結合有兩個區(qū)域,Fc 與Fab。主要與Fc的CH2,CH3 結合的是Protein A 的B，與Fab 結合位點是VH3 |
各環(huán)節(jié)中濃縮和換液采用膜包還是中空纖維，二者有什么區(qū)別？
答疑解惑
“用途區(qū)別"
中空纖維 | 中空纖維一般用于樣品中含有沉淀、渾濁、顆粒等，以及低剪切力的樣品 |
| 膜包 | 膜包用于樣品比較干凈的樣品 |
“在工藝中區(qū)別"
中空纖維 | 用于低剪切力的病毒濃縮；固液分離；澄清；以及包涵體復性等 |
| 膜包 | 用于緩沖液更換，濃縮等 |
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層析除病毒驗證，
需要做舊膠的驗證嗎？
答疑解惑
關于病毒驗證是否需要做舊膠還沒有聽到法規(guī)的要求。新藥報批時一般要求工藝驗證，在工藝驗證中會涉及層析介質(zhì)的壽命。層析介質(zhì)壽命的確定是有效去除雜質(zhì)達到質(zhì)量要求。親和層析/離子交換介質(zhì)已經(jīng)有文章證明Protein A在壽命內(nèi)有*病毒去除。
非糖基化的抗體
采用什么技術來去除？
答疑解惑
非糖基化的抗體一般是抗體片段(CHO表達的為有糖基)，抗體片段一般使用Protein L吸附Fab
陰離子交換低電導較好，但zui近做了DOE，
發(fā)現(xiàn)電導11比較好，何解？
答疑解惑
陰離子交換一般采用流穿模式（FT），所以需要一定的電導率讓抗體（單體）流穿，其他雜質(zhì)吸附。不同的樣品還是以實驗為準
能否介紹一些FC-肽融合蛋白的精細純化方法？
答疑解惑
FC-融合蛋白的的精細純化一般采用陰/陽離子交換。也有使用HIC，或羥基磷灰石的純化。還要根據(jù)樣品做DOE。
柱高不變，直徑由1.6cm放大到比如20cm，柱壓會增大多少？
答疑解惑
層析放大的原理為直徑放大，柱高不變（即線性流速或保留時間不變）。在放大時層析柱的分配器，以及篩板設計非常重要。設計優(yōu)異的柱壓一般不會增大。
工藝驗證中需要確定CQA，CPP，可以針對一個層析方法說明一下確認的方法嗎？
答疑解惑
首 先確定不同步驟主要去除雜質(zhì)以及去除雜質(zhì)能力，例如陽離子去除聚體步驟，經(jīng)過此步驟聚體可以從2%降至0.3%。經(jīng)過DOE實驗確定，CPP： 為上樣量（xx-xxmg/ml），樣品電導率（~~），洗脫時的電導率范圍。在以上的條件下可以滿足CQA（0.3%以下）聚體的要求。
陰離子流穿模式，說的載量指的是目的蛋白載量？VH一個domain的純化可以用Protein A親和嗎？
答疑解惑
陰離子流穿模式（FT）的載量指的是抗體的量。一般在上樣是抗體流穿，檢測純度，HCP等，至超標時上樣的抗體的量為載量
Protein A （重組的，非修飾的）與VH3結合
3、案例分享 ?用實驗中的真實案例答疑解惑
有沒有關于酸堿異構體組分降低的案例分享？
答疑解惑
對于酸堿異構體的分離一般比較困難，因為差異較小。在GE的應用文獻中有使用Capto S ImpAct分離的。一般使用陽離子交換（顆粒小的30-40um），做線性梯度洗脫。也可以在DOE時設計鹽梯度與改變pH同時的洗脫策略。
現(xiàn)在我做的抗體，proteinA 捕獲時只要載量高就會出現(xiàn)渾濁，低載量澄清？
答疑解惑
| Protein A的層析介質(zhì) | 一般Protein A的層析介質(zhì)載量在30-50g/l，洗脫時可以達到10-20mg/ml濃度，工程抗體的溶解度較高，一般較少出現(xiàn)沉淀。但是有時洗脫時由于HCP沒有去除干凈，洗脫液中會有沉淀，過夜或低pH后更明顯 |
| 建議 | 檢測抗體的溶解度，檢測洗脫的HCP的量 |
| 此步驟可以使用低pH（pH在5-6，要實驗），加入一些鹽或低濃度尿素等 |
宿主DNA和宿主蛋白是否是同步去除的，宿主DNA如何更好去除？
答疑解惑
DNA/HCP一般會同步去除，只是不同步驟去除的量稍有不同。 對于DNA的去除，親和/陽離子交換/HIC不吸附，陰離子交換吸附。只有實驗才能確定您的項目哪種。
抗體的等電點能否用生物信息學的方法預測，消光系數(shù)怎么計算？
答疑解惑
一般預測的軟件得到的一些參數(shù)不是很準確，不同的表達系統(tǒng)，不同的培養(yǎng)方法，所得到的等電點不同。所以只能參考。
| 消光系數(shù)的公式 | A=ECL，E消光系數(shù)，C濃度，L光徑。使用純的抗體樣品標定消光系數(shù)。 |
| 小技巧 | 使用1mlHitrap MabSelect Sure純化收集洗脫樣品，使用Lowry或Bradford標定消光系數(shù)。在之后的工藝探索中可以簡單的使用紫外吸收值定量。 |
