RNA制備中常見(jiàn)問(wèn)題和解答
1、塑料制品、玻璃和金屬物品的處理
(a)塑料制品：盡可能使用無(wú)菌,一次性塑料制品.已標(biāo)明RNase-Free 的塑料制品,如沒(méi)有開(kāi)封使用過(guò),通常沒(méi)有必要再次處理.對(duì)于國(guó)產(chǎn)塑料制品,原則上都必須處理方可使用.處理方法如下：
(1)在玻璃燒杯中注入去離子水,加入DEPC使DEPC的終濃度為0.1%.注意：DEPC為劇毒物,活性很強(qiáng),小心在通風(fēng)柜中使用.
(2)將待處理的塑料制品放入一個(gè)可以高溫滅菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中.
(3)在通風(fēng)柜中室溫處理過(guò)夜.
(4)將DEPC水溶液小心倒到廢液瓶中,用鋁箔封住含已DEPC水處理過(guò)的塑料制品的燒杯,高溫高壓蒸氣滅菌至少30分鐘.
(5)烘箱用合適的溫度烘拷至干燥.置于干凈處備用.
(b)玻璃和金屬物品
250°C烘烤3小時(shí)以上.
2、RNase 是RNA制備的殺手
答：RNase酶非常穩(wěn)定,是導(dǎo)致RNA降解zui主要的物質(zhì).它在一些的條件可以暫時(shí)失活,但限制因素去除后有迅速?gòu)?fù)性.用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能是RNase*失活.它廣泛存在于人的皮膚上,因此,在與RNA制備有關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí),必須戴手套.RNase的又一污染源是取液器.根據(jù)取液器制造商的要求對(duì)取液器進(jìn)行處理.一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部,基本達(dá)到要求.取 RNase-free的物品時(shí)必須戴手套.
3、采用什么方式純化總RNA？
答：我們提供多種RNA純化方式,根據(jù)您對(duì)RNA純化技術(shù)的熟悉程度,選用不同的純化手段.從產(chǎn)品使用效果看,基于TriBlue的一步法分離總RNA試劑盒（K311,K321系列）無(wú)論是新手還熟手都可以得到比較理想的結(jié)果.如果您對(duì)苯酚過(guò)敏,出于對(duì)環(huán)境的保護(hù),您可以選用整個(gè)分離流程都不使用苯酚的試劑盒（K361系列）.從產(chǎn)品形式上,我們的總RNA分離分醇沉淀離心式和離心吸附柱方式兩種.沉淀方式總的產(chǎn)量比較高,純化規(guī)模機(jī)動(dòng),但是純度不及吸附柱方式；吸附柱方式操作比較簡(jiǎn)單,純度高,受吸附容量的影響,產(chǎn)量收到影響.
4、什么時(shí)候需要分離mRNA?
答：常規(guī)RT-PCR鑒定基因表達(dá)水平的,一般都可以采用總RNA作為RT-PCR 的模板,但是做cDNA文庫(kù),克隆豐度極低的基因,大多數(shù)DD-PCR, 削減雜交等需要純化的mRNA.一般用oligo (dT)-cellulose或在磁珠上偶連oligo (dT),從組織或總RNA種直接分離mRNA.
5、如何判定分離的總RNA的純度？
答：需要從兩個(gè)方面著手,缺一不可,特別是新手（1）測(cè)定OD260/OD280的比值,測(cè)定時(shí),RNA需要用10mM Tris-HCl,pH7.5稀釋.理想的RNA, OD260/280在1.9-2.1之間.比值如果過(guò)低,可能有蛋白質(zhì)污染,過(guò)高RNA可能已發(fā)生降解.（2）瓊脂糖變性電泳觀察rRNA的完整性和強(qiáng)度.變性電泳需要采用MOPS系統(tǒng),不可以采用DNA 電泳用的TBE或TAE系統(tǒng).如果OD260/OD280過(guò)低（<1.7）,通?？梢酝ㄟ^(guò)減少組織和細(xì)胞的用量來(lái)實(shí)現(xiàn).
6、什么時(shí)候需要加入RNA-Carrier?
答：樣品很少或樣品中RNA含量低,制備RNA時(shí)需要加入一定的 RNA載體,以提高RNA純化的得率.常用的載體有PolyAcryl Carrier, Poly A, Poly C和Glycogen.一定濃度范圍的 Carrier對(duì)一些RNA的下游應(yīng)用沒(méi)有影響,如RT-PCR, Northern Blot.
7、如何除去純化的RNA中微量的基因組DNA?
答：無(wú)論用種方式制備的總RNA,要保證不含基因組DNA是不現(xiàn)實(shí)的.如果您希望得到DNA free 的RNA樣品,需要用RNase free的DNase I處理.
8、純化的RNA樣品如何保存？
答：如果希望得到*的結(jié)果,純化的RNA需要立即用于下游實(shí)驗(yàn).RNA可以保存在-80C冰箱,長(zhǎng)期保存可以置于液氮中.如果沒(méi)有-80冰箱或液氮,RNA也可以保存在異丙醇或乙醇中,-20度保存.
9、組織和細(xì)胞樣品如何收集,保存？
答：組織樣品收集后,需要立即保存在液氮中,或在樣品中加入一定量的保護(hù)劑,有一些商業(yè)化的產(chǎn)品可以選用.一般實(shí)驗(yàn)收集50-100mg組織就足夠了.
10、如何估計(jì)RNA的產(chǎn)量？
答：能計(jì)算出RNA的產(chǎn)量,通常都是有比較多的起材料,但是很多情況下能夠取得材料很少,所制備得到的RNA無(wú)法通過(guò)分光光度的方法測(cè)定含量和濃度.RNA的含量與組織和細(xì)胞的類(lèi)型有比較大的關(guān)系, 同時(shí)與抽提的方式有關(guān),例如用抽提小鼠組織100mg 肝可以得到500ug總RNA, 100mg肺 得到200ug總RNA, 1百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞Hela細(xì)胞可以得到15ug左右的總RNA. mRNA的含量一般占總RNA含量的2-5%.根據(jù)這樣一些經(jīng)驗(yàn)值,估算出您可能得到的量.樣品如果低于20mg或10000個(gè)細(xì)胞,在抽提時(shí)需要考慮加入合適的RNA沉淀載體.
11、RNA制備過(guò)程中那個(gè)環(huán)節(jié)要特別注意？
答：一般情況下,細(xì)胞和組織在RNA抽提液中都可以保存一段時(shí)間,因?yàn)閹缀跛械腞NA的抽提裂解液中都含有高濃度的異硫氰酸胍等強(qiáng)變性劑, RNase基本是不起作用的,操作即使是粗放一些,也沒(méi)有多達(dá)關(guān)系.但是通常是離心后取上清,這時(shí)候RNA已沒(méi)有保護(hù),操作要特別小心.
